Separación y cuantificación de fracciones proteínicas del suero.

Objetivos:

1.                Aplicar la técnica de precipitación salina selectiva para separar las diferentes fracciones de proteína presentes en una mezcla.

2.                Determinar el porcentaje de composición de una mezcla de proteína mediante análisis colorimétrico.

 

Marco Teórico:

El suero es el líquido de color ámbar que se obtiene por centrifugación y o decantación de la sangre que se ha coagulado.  En el proceso de coagulación se separan todas las proteínas de la coagulación (fibrinógeno), conjuntamente con las células plasmáticas. 

La viscosidad del suero de debe en gran parte a la albúmina, que  constituye el 55% de las proteínas totales.  Junto con los electrolitos, la albúmina participa en la regulación del volumen sanguíneo, al evitar que el agua que forma parte de la sangre difunda hacia los espacios intersticiales; también participa en el transporte de ácidos grasos.  Las globulinas comprenden el 38% de las proteínas plasmáticas y corresponden a los anticuerpos o inmunoglobulinas (Ig) que liberan las células plasmáticas.  La función anticuerpo representa un crucial mecanismo de defensa contra infecciones virales y bacterianas de los animales y el hombre.  Tres fracciones de globulinas (alfa, beta y gamma) se pueden cuantificar y caracterizar por fraccionamiento con soluciones salinas.

Materiales:

·         Tubos de ensayo.

·         Gotero.

·         Pipetas 2, 5 y 10 ml.

·         Colorímetro.

·         Espátula.

·         Centrifugadora.

Reactivos:

Suero sanguíneo.	El suero, es el remanente del plasma sanguíneo una vez consumidos los factores hemostáticos por la coagulación de la sangre. manejar con extremo cuidado pues es un líquido fisiológico.
Cloruro de sodio 0.9 %.	Ingestión Peligroso en grandes cantidades; su uso a largo plazo en cantidades normales puede traer problemas en los riñones. Inhalación Puede producir irritación en altas cantidades. Piel Puede producir resequedad. Ojos Puede producir irritación y molestia.
Reactivo de Biureth.	El Reactivo de Biuret es aquel que detecta la presencia de proteínas, péptidos cortos y otros compuestos con dos o más enlaces peptídico en sustancias de composición desconocida. Está hecho de hidróxido potásico (KOH) y sulfato cúprico (CuSO4), junto con tartrato de sodio y potasio (KNaC4O6·4H2O).
Solución patrón de albúmina.	La albúmina es una proteína que se encuentra en gran proporción en el plasma sanguíneo, siendo la principal proteína de la sangre y a su vez la más abundante en el ser humano. Es sintetizada en el hígado.
Sulfato de sodio 15.75%, 19.9% y 27.2%.	No causa efectos serio en la salud. por ingestión produce una leve irritación.
Celite.

Esquema experimental:

      Determinación de las Proteínas Totales

Tubo	Suero	Albúmina	NaCl 0.9 %	Biureth	Agitar	Reposar
A = muestra	0.1 mL	-	1.9 mL	8.0 mL	por inversión	10 min.
A.1 = Patrón	-	0.1 mL	1.9 mL	8.0 mL	por inversión	10 min.
A.2= blanco	-	-	2.0 mL	8.0 mL	por inversión	10 min.

      Determine la lectura en el colorímetro a 540 nm.

    

      Separación y Determinación de las fracciones de proteínas.

Tubo	Suero	Na2SO4	Celite	Agitar	Reposar
B	0.5 mL	10 mL  al 15.75 %	0.5 g	por inversión	1 hora
C	0.5 mL	10 mL  al 19.9  %	0.5 g	por inversión	1 hora
D	0.5 mL	10 mL al  28  %	0.5 g	por inversión	1 hora

      Centrifugue por 5 min. a 3000 r.p.m.

      Decante el sobrenadante y adicione en tubos de ensayo las siguientes cantidades:

Tubo	sobrenadante	Biureth	Agitar	Reposar
B.1	2 mL	8.0 mL	por inversión	10 min.
C.1	2 mL	8.0 mL	por inversión	10 min.
D.1	2 mL	8.0 mL	por inversión	10 min.

      Determine la lectura en el colorímetro a 540 nm.