Determinación Cualitativa de Carbohidratos.

Objetivos:

1.    Realizar pruebas cualitativas para detectar carbohidratos con base en la formación furfural.

2.    Ensayar la prueba para azúcares reductores.

3.    Realizar pruebas cualitativas para polisacáridos.

Marco Teórico:

Los carbohidratos son compuestos orgánicos, formados primordialmente por carbono, hidrógeno y oxígeno.  Se encuentran en muchos productos naturales y son una de las fuentes principales de energía para los organismos quimiotróficos.

La unidad fundamental de los carbohidratos son los monosacáridos, estos son polihidroxialdehídos o polihidroxicetonas.

Los monosacáridos se combinan, con la pérdida de moléculas de agua uniéndose mediante enlaces glicosídicos, formándose oligosacáridos y polisacáridos.

En presencia de ácidos  no oxidantes, los carbohidratos se deshidratan y forman  furfural si el monosacárido es una pentosa o hidróximetilfurfural, si el monosacárido es una hexosa.

Cuando la reacción de deshidratación se efectúa con la ayuda del ácido sulfúrico concentrado y el color se desarrolla con alfa naftol, la prueba se denomina reacción de Molisch.

Otra prueba basada en la formación de furfural es la prueba de Seliwanoff.  Esta prueba consiste en la reacción del resorcinol (1,3 dihidróxibenceno) con las cetosas deshidratadas por el HCI concentrado.  Se observa la formación de un complejo rojo.

La prueba de Bial se utiliza para identificar pentosas y consiste en calentar la pentosa con HCI conc. se forma furfural que se condensa con orcinol en presencia de iones férricos para dar un color verde azuloso.

Prueba para azúcares reductores: las  propiedades reductoras de los azúcares depende de la presencia de grupos aldehídos o cetonas, reales o potenciales.  Al calentar ciertas soluciones de azúcares, en presencia de determinados iones metálicos, el grupo carbonilo se oxida y el ión metálico se reduce.

Algunas de éstas pruebas son:  La de Benedict, que identifica carbohidratos en general y es positiva cuando se observa la aparición de un precipitado amarillo, anaranjado o rojo ladrillo; y la prueba de Barfoed, que es similar a la de Benedict, excepto que el reactivo es ligeramente ácido o sirve para detectar la presencia de monosacáridos.

Los polisacáridos son cadenas muy largas o polímeros de monosacáridos, lineales o ramificados.  Se dividen en heteropolisacáridos y homopolisacáridos dependiendo si la forman distintos o iguales unidades simples.

Algunos polisacáridos de reserva importante lo son el almidón formado por dos constituyentes: amilosa y amilopectina; y el glucógeno llamado “almidón animal”, se encuentra en el hígado y músculos.

Materiales y Reactivos

v  Tubos de ensayo

v  Gradillas

v  Goteros

v  Probetas

v  Vasos químicos

Reactivos	Toxicidad
Soluciones al 1% de glucosa	La glucosa es un monosacárido con fórmula molecular C6H12O6, la misma que la fructosa pero con diferente posición relativa de los grupos -OH y O=. Es una hexosa, es decir, que contiene 6 átomos de carbono, y es una aldosa, esto es, el grupo carbonilo está en el extremo de la molécula.
fructuosa	La fructosa, o levulosa, es una forma de azúcar encontrada en las frutas y en la miel. Es un monosacárido con la misma fórmula empírica que la glucosa pero con diferente estructura. Es una cetohexosa (6 átomos de carbono). Su poder energético es de 4 kilocalorías por cada gramo. Su formula química es C6H12O6
lactosa
almidón	El almidón es un polisacárido de reserva alimenticia predominante en las plantas, constituido por amilosa y amilopectina. Proporciona el 70-80% de las calorías consumidas por los humanos de todo el mundo
reactivo de Benedict	Tomar aire fresco. Llamar al médico si prosigue el malestar. Tras contacto con la piel: aclarar con abundante agua. Quitar la ropa contaminada. Tras ingestión: beber abundante agua, provocar vómitos. Avisar al médico. Tras contacto con los ojos: las molestias, llamar al oftalmólogo aclarar con abundante agua, con los párpados bien abiertos. Si no desaparecen Tras inhalación:
Lugol	Peligroso para organismos acuáticos. Puede causar efectos adversos por largo tiempo al medio ambiente acuático. Irritante en caso de contacto con los ojos y la piel. En caso de accidente por rotura y/o derrame, recoja el líquido con polvos altamente adsorbentes.
alfa –Naftol en etanol	Nocivo en contacto con la piel y por ingestión. R 37/38 Irrita las vías respiratorias y la piel. R 41 Riesgo de lesiones oculares graves.
H2SO4 conc	corrosivo irritante severo de piel jos boca vias respiratorioas. no inahalar no ingerir.
reactivo de Bial
reactivo de Seliwanoff
reactivo de Barfoed

Diseño experimental:

1.    Pruebas basadas en  la formación de furfurales

2. Pruebas para azúcares reductores:



3. Prueba del yodo:

Estudio de Inhibición de la Fenoloxidasa de la papa

 Objetivos:

a.    Determinar la actividad enzimática de la fenoloxidasa presente  en extractos de papa.

b.    Calcular la Km de la enzima de los datos de actividad enzimática, frente a diferentes concentraciones de sustrato.

c.    Estudiar el tipo de inhibición que ejerce el ácido benzoico sobre la actividad de la fenoloxidasa de la papa.

Marco Teórico:

Las enzimas son catalizadores muy potentes y eficaces, químicamente son proteínas.  Como catalizadores, las enzimas actúan en pequeña cantidad y se recuperan indefinidamente.  No llevan a cabo reacciones que sean energéticamente desfavorables, no modifican el sentido de los equilibrios químicos, sino que aceleran su consecución.

La característica más sobresaliente de las enzimas es su elevada especificidad.  Esta es doble y explica que no se formen subproductos:

(1) Especificidad de sustrato.  El sustrato (S) es la molécula sobre la que el enzima ejerce su acción catalítica.

(2) Especificidad de acción.  Cada reacción está catalizada por un enzima específico.

La acción enzimática se caracteriza por la formación de un complejo que representa el estado de transición.

Los estudios de inhibición enzimática clásica reversible implican el análisis gráfico de los recíprocos de las velocidades iniciales 1/V_o y de las concentraciones de sustrato 1/ [S]

Materiales y Reactivos.

Baño termométrico

tubos de ensayo,

gradilla,

bureta de 50 mL,

goteros,

 pipetas de 5 y 10 mL,

 erlenmeyers de 125 mL,

gaza,

embudo buchner,

 licuadora,

espectrofotómetro visible.

Reactivos	Toxicidad
Pirogalol (1,2,3 trihidroxibenceno) 1 % (solución madre)	vértigo, dolor de cabeza, dificultad respiratoria, náusea, jadeo, dolor de garganta.
amortiguador, citrato 0.1 M de pH 6	Los citratos son las sales del ácido cítrico, y son buenos reguladores de acidez. A continuación se incluye una lista de los principales Forma ionizada del ácido cítrico. Citrato de aluminio. Citrato de calcio o Sal amarga, utilizada en la preservación y condimentación de alimentos. Citrato de potasio, utilizado como solución buffer para regular el pH. Citrato de sildenafil, es el nombre del producto Viagra®, entre otros. Citrato de sodio, utilizado como solución buffer para regular el pH, y para evitar la coagulación de la sangre. Citrato de cobre
NaF 1%	El fluoruro de sodio de fórmula NaF, es un compuesto químico inorgánico, de características sólido, generalmente se presenta como un polvo cristalino, blancuzco descolorido y es la principal fuente de fluoruro ion. Su punto de fusión está en 992 °K y su peso específico es de 2,9 (agua=1) Posee una presión de vapor de 1,33 hPa. Su solubilidad en agua es de 42 g/L (20 °C / 68 °F).
Acido benzoico 0.02 %	En personas sensibles se pueden producir reacciones alérgicas. En combinación con ácido ascórbico (E300), se puede formar benceno, un hidrocarburo altamente cancerígeno. También la presencia de E220 (dióxido de azufre y sus derivados), colorantes artificiales diazoicos, ácido salicílico, etc.,pueden aumentar los riesgos.
Sulfato de amonio	Causa Inflamación, irritación, enrojecimiento y dolor Ardor de garganta, dolor estomacal nausea.  Causa irritación en las vías gastroinstentinales, Causa vómito y diarrea. Ardor de garganta, tos, deficiencia respiratoria. Causa irritación en las vías respiratorias
Papa congelada.

Diseño experimental:

Electroforesis de proteínas del suero humano
en gel de poliacrilamida bajo condiciones
desnaturalizantes (sds-page)

Objetivos:

•  Ilustrar los principios básicos de una técnica de uso frecuente para la investigación de laboratorio especializados de análisis.
•  Determinar la relación que existe entre el gel y el movimiento de las partículas
• Determinar el peso molecular de una proteína mediante la técnica de electroforesis.

Introducción:

Electroforesis

Electroforesis es la migración de moléculas cargadas en solución como respuesta a la presencia de un campo eléctrico. La velocidad de migración depende principalmente de la fuerza del campo, de la carga, forma, masa y tamaño de la molécula, así como de la fuerza iónica, viscosidad y temperatura del medio en el que las moléculas se estén moviendo. Como herramienta analítica, la electroforesis es rápida, sensible y simple. La electroforesis es ampliamente usada para estudiar propiedades de especies cargadas en solución, y como una técnica de separación.

Matrices de soporte

Generalmente la muestra es corrida en matrices como papel, acetato de celulosa, geles de almidón, agarosa ó poliacrilamida. La matriz inhibe la difusión osmótica, así como el mezclado producido por convección térmica., además proveee un registro del proceso electroforético ya que puede marcarse y usarse para mediciones, autoradiografía ó almacenamiento. Las matrices de soporte más ampliamente usadas (agarosa y poliacrilamida) proveen además, un medio para separar moléculas por tamaño, ya que son geles porosos y pueden actuar como tamices moleculares.

Separación de proteínas

Las proteínas son compuestos anfotéricos, por lo tanto su carga neta está determinada por el pH del medio en el que están suspendidas. En una solución con un pH por encima de su punto isoeléctrico, una proteína tiene una carga neta negativa y en un campo eléctrico migra hacia el ánodo, mientras que migrará hacia el cátodo a pHs por debajo de su punto isoeléctrico. La carga presente en una proteína es independiente de su tamaño y varía de una proteína a otra, por lo tanto, la separación electroforética de proteínas bajo condiciones no desnaturalizantes se realiza en virtud de su carga y tamaño.

Separación de proteínas bajo condiciones desnaturalizantes

El dodecil sulfato de sodio (SDS) es un detergente aniónico que desnaturaliza proteínas “envolviendo” el esqueleto polipeptídico, la unión presenta una relación de masas 1,4:1. El SDS confiere carga negativa al polipéptido en relación a su longitud. Usualmente es necesario reducir los puentes disulfuro de las proteínas para permitir la unión cuantitativa del SDS, esto se lleva a cabo en caliente con 2-mercaptoetanol. En SDS-PAGE, la migración no es determinada por la carga eléctrica del polipéptido, sino por su peso molecular.

Sistemas de amortiguador continuos y discontinuos

Un sistema continuo tiene un gel de separación sencillo y usa el mismo amortiguador en los tanques y en el gel, en un sistema discontinuo, un gel de poro grande y no restrictivo, llamado gel de apiñamiento, es colocado en la parte superior del gel de separación, llamado gel de resolución. Cada gel está hecho con un amortiguador diferente, y el amortiguador de los tanques es diferente al de los geles. La mayor ventaja de los sistemas de amortiguador discontinuos sobre los continuos es que pueden agregarse volúmenes relativamente grandes de muestras de proteína diluída a los geles sin comprometer la resolución, esto se debe a que las proteínas son concentradas en zonas extremadamente estrechas durante su migración en el gel de apiñamiento. La resolución alcanzada con un sistema discontinuo es muy superior a la obtenida con sistema continuo.
La justificación teórica de proceso electroforético en los sistemas discontinuos será discutida en la sesión de laboratorio.

Geles de poliacrilamida

Los geles de poliacrilamida se obtiene polimerizando monómeros de acrilamida (CH₂=CHCONH₂) en cadenas largas y entrecruzándolas con un compuesto bifuncional como N,N’-metilenbisacrilamida ( CH₂(NHCOCH=CH₂)₂, usualmente llamada bisacrilamida). La polimerización es iniciada mediante la adición de persulfato de amonio ó riboflavina, y se usa N,N,N’,N’-tetrametilenetilendiamina (TEMED) como acelerador del proceso de polimerización. Ambos iniciadores de polimerización generan radicales libres, el persulfato de amonio espontáneamente en solución (enlace peróxido), y la riboflavina mediante fotodescomposicion.
El tamaño de poro efectivo de los geles de poliacrilamida depende inversamente de la concentración de acrilamida, y se usan geles con concentraciones de acrilamida desde 2.5% (moléculas con peso mayor de 10⁶) hasta 30% (polipéptidos con peso de ~2000). Para una concentración de monómero dada, las propiedades del gel varían con la proporción de agente entrecruzador usado, al aumentar éste el tamaño de poro decrece, alcanzando un mínimo cuando representa un 5% de la cantidad total de monómero.

pH

Los límites prácticos de pH para realizar PAGE están entre pH 3 y 10, ya que algunas reacciones hidrolíticas (como desaminación) ocurren a pHs extremos. La elección del pH para PAGE depende de dos consideraciones opuestas, a pHs cercanos al punto isoeléctrico de las proteínas a separar, la diferencia de carga entre ellas es grande, aumentando la posibilidad de separación, sin embargo, al ser pequeña la carga, los tiempos de corrido son largos, llevando a un aumento en el ensanchamiento de banda. En SDS-PAGE los complejos polipéptido-SDS están negativamente cargados en un rango amplio de pH, por lo tanto el pH no es crítico.

Marcaje de las bandas

Las bandas pueden ser evidenciadas mediante diferentes métodos como tinción con colorantes, revelado “fotográfico”, autorradiografía ó con marcaje fluorescente. En la presente aplicación se usará marcaje con plata, método altamente sensible y rápido. Las bandas de proteína son fijadas en la posición final después de la electroforesis precipitando las proteínas con metanol y ácido acético, las bandas son sensibilizadas con tiosulfato de sodio, que mejora el contraste entre las bandas teñidas y el fondo del gel, posteriormente el gel se trata con nitrato de plata, los iones plata se complejan con la proteina, y en un paso posterior, similar al revelado fotográfico, los iones plata complejados sufren una reducción mucho mas rápida que los iones plata libres, formando partículas coloidales de plata en las dos superficies del gel, preferencialmente sobre las bandas de proteína, haciéndolas visibles. Los límites de detección son del orden de ng de proteina.

Electroforesis de proteínas del suero humano

Las proteínas presentes en el suero humano pueden agruparse en 4 fracciones dependiendo de su mobilidad electroforética: Albúminas, alpha, beta y gamma globulinas. La mayoría de las alpha y beta globulinas son sintetizadas en el hígado, mientras que las gamma globulinas son producidas por linfocitos y células plasmáticas.

Las albúminas del suero pertenecen a una familia multigénica de proteínas que conforman la mayor fracción de proteínas solubles en el sistema circulatorio, estas desempeñan diversas funciones fisiológicas, como regulación de la presión osmótica, transporte y distribución de un gran número de ligandos endógenos y exógenos que incluyen ácidos grasos, aminoácidos, esteroides, metales como calcio, cobre y zinc y fármacos. Las alpha1 globulinas incluyen a-1-antitripsina, a-1-antiquimotripsina y a-1-lipoproteína (LDH), entre otras. Entre las alpha2 globulinas están la a-2-macroglobulina (inhibidor de proteasas), haptoglobulina (se une a hemoglobina libre), proteína C (inhibidor de factores de coagulación), ceruloplasmina (transportador de cobre) y a-2-lipoproteína (VLDL). Las beta1 globulinas incluyen transferrina(capta hierro) y hemopexina. Las beta2 globulinas incluyen plasminógeno, b-2-lipoproteína (LDL) y alguna proporción de IgA. El fibrinógeno también migra en esta región. Las gamma globulinas consisten en las inmunoglobulinas IgM, IgA e IgG. 

MATERIALES Y EQUIPOS

Cámara de electroforesis
Fuente de voltaje
Enfriador a 4°C
Solución stock monómero (Acrilamida 29,2%, bisacrilamida 0,8%)
Amortiguador Tris-HCl 1,5M pH 8,8
Amortiguador Tris-HCl 0,5M pH 6,8
Amortiguador Trisbase-glicina pH 8,3 (5X)
Solución stock SDS 10%
Persulfato de amonio al 10% (recién preparado)
TEMED
Amortiguador reductor para las muestras : 
SDS                  
 2-mercaptoetanol  Glicerol
Azul de bromofenol
Amortiguador pH 6,8
Fijador A (Metanol 50%, ácido acético 5%)
Fijador B (Metanol 50%)
Sensibilizador (Tiosulfato de sodio 0,02%)
Marcador (Nitrato de plata 0,1%)
Revelador (Formaldehído 0,04%, carbonato de sodio 2%)
Enjuage (Acido acético 5%)
Agua desionizada




Reactivos:

Acrilamida	Principal monómero de la poliacrilamida blanca incolora cristalina probablemente carcinógeno humano.
Bisacrilamida	Dañino si es ingerido, inhalado o absorbido por la piel, causa irritación de la piel, ojos, y vías respiratorias. Puede afectar al sistema nervioso central.
Azul de bromofenol	No produce irritaciones en la piel, puede ser nocivo en la ingestión, no se conoce ningún efecto sensibilizante.

Sección experimental:

Sembrado de la muestra y corrido de la electroforesis

Después de armada la celda se agrega el amortiguador de corrido (véase ELECTROFORESIS VERTICAL) y se siembran unos 4ml de muestra en cada reservorio, se tapa la celda y se hace el corrido a 200V por 42 minutos.

Revelado de la placa

La placa se coloca en los siguientes baños por el tiempo especificado:

- Fijador A, 20min
- Fijador B, 10min
- Agua, 10min
- Sensibilizador, 1min
- Agua, 1min (2 veces)
- Marcador, 20min, 4°C
- Agua, 1min (2 veces)
- Revelador. Se lleva a la intensidad deseada (Usar fondo blanco)
- Enjuage, 1min

Separación y cuantificación de fracciones proteínicas del suero.

Objetivos:

1.                Aplicar la técnica de precipitación salina selectiva para separar las diferentes fracciones de proteína presentes en una mezcla.

2.                Determinar el porcentaje de composición de una mezcla de proteína mediante análisis colorimétrico.

 

Marco Teórico:

El suero es el líquido de color ámbar que se obtiene por centrifugación y o decantación de la sangre que se ha coagulado.  En el proceso de coagulación se separan todas las proteínas de la coagulación (fibrinógeno), conjuntamente con las células plasmáticas. 

La viscosidad del suero de debe en gran parte a la albúmina, que  constituye el 55% de las proteínas totales.  Junto con los electrolitos, la albúmina participa en la regulación del volumen sanguíneo, al evitar que el agua que forma parte de la sangre difunda hacia los espacios intersticiales; también participa en el transporte de ácidos grasos.  Las globulinas comprenden el 38% de las proteínas plasmáticas y corresponden a los anticuerpos o inmunoglobulinas (Ig) que liberan las células plasmáticas.  La función anticuerpo representa un crucial mecanismo de defensa contra infecciones virales y bacterianas de los animales y el hombre.  Tres fracciones de globulinas (alfa, beta y gamma) se pueden cuantificar y caracterizar por fraccionamiento con soluciones salinas.

Materiales:

·         Tubos de ensayo.

·         Gotero.

·         Pipetas 2, 5 y 10 ml.

·         Colorímetro.

·         Espátula.

·         Centrifugadora.

Reactivos:

Suero sanguíneo.	El suero, es el remanente del plasma sanguíneo una vez consumidos los factores hemostáticos por la coagulación de la sangre. manejar con extremo cuidado pues es un líquido fisiológico.
Cloruro de sodio 0.9 %.	Ingestión Peligroso en grandes cantidades; su uso a largo plazo en cantidades normales puede traer problemas en los riñones. Inhalación Puede producir irritación en altas cantidades. Piel Puede producir resequedad. Ojos Puede producir irritación y molestia.
Reactivo de Biureth.	El Reactivo de Biuret es aquel que detecta la presencia de proteínas, péptidos cortos y otros compuestos con dos o más enlaces peptídico en sustancias de composición desconocida. Está hecho de hidróxido potásico (KOH) y sulfato cúprico (CuSO4), junto con tartrato de sodio y potasio (KNaC4O6·4H2O).
Solución patrón de albúmina.	La albúmina es una proteína que se encuentra en gran proporción en el plasma sanguíneo, siendo la principal proteína de la sangre y a su vez la más abundante en el ser humano. Es sintetizada en el hígado.
Sulfato de sodio 15.75%, 19.9% y 27.2%.	No causa efectos serio en la salud. por ingestión produce una leve irritación.
Celite.

Esquema experimental:

      Determinación de las Proteínas Totales

Tubo	Suero	Albúmina	NaCl 0.9 %	Biureth	Agitar	Reposar
A = muestra	0.1 mL	-	1.9 mL	8.0 mL	por inversión	10 min.
A.1 = Patrón	-	0.1 mL	1.9 mL	8.0 mL	por inversión	10 min.
A.2= blanco	-	-	2.0 mL	8.0 mL	por inversión	10 min.

      Determine la lectura en el colorímetro a 540 nm.

    

      Separación y Determinación de las fracciones de proteínas.

Tubo	Suero	Na2SO4	Celite	Agitar	Reposar
B	0.5 mL	10 mL  al 15.75 %	0.5 g	por inversión	1 hora
C	0.5 mL	10 mL  al 19.9  %	0.5 g	por inversión	1 hora
D	0.5 mL	10 mL al  28  %	0.5 g	por inversión	1 hora

      Centrifugue por 5 min. a 3000 r.p.m.

      Decante el sobrenadante y adicione en tubos de ensayo las siguientes cantidades:

Tubo	sobrenadante	Biureth	Agitar	Reposar
B.1	2 mL	8.0 mL	por inversión	10 min.
C.1	2 mL	8.0 mL	por inversión	10 min.
D.1	2 mL	8.0 mL	por inversión	10 min.

      Determine la lectura en el colorímetro a 540 nm.